پيٽر سارنو پاران ايڊٽ ڪيو ويو، اسٽينفورڊ يونيورسٽي اسڪول آف ميڊيسن، اسٽينفورڊ يونيورسٽي، ڪيليفورنيا، 25 ڊسمبر 2020 تي منظور ڪيو ويو (جائزو ڪيو ويو آڪٽوبر 25، 2020 تي)
اسان ڪورونوايرس-ٽرانسڪرپشن ڪمپليڪس جي نقل ۾ سبونٽس جي وچ ۾ رابطي جي رپورٽ ڪريون ٿا، جيڪي نقل ۽ ارتقائي تحفظ لاء ضروري آهن.اسان ثبوت فراهم ڪيو ته nsp12 سان لاڳاپيل NiRAN ڊومين ۾ nucleoside monophosphate (NMP) ٽرانزيس سرگرمي آهي، ۽ nsp9 (هڪ آر اين اي بائنڊنگ پروٽين) کي نشانو بڻايو ويو آهي.NiRAN NMP moiety جي covalent ملحق کي محفوظ ڪيل nsp9 امينو ٽرمينس کي هڪ رد عمل ۾ متحرڪ ڪري ٿو جيڪو Mn2+ آئنز ۽ ڀرپاسي محفوظ Asn باقيات تي ڀاڙي ٿو.اهو معلوم ٿيو ته NiRAN سرگرمي ۽ nsp9 NMPylation ڪورونا وائرس جي نقل لاءِ ضروري آهن.ڊيٽا اسان کي نسٽڊ وائرس اينزائم مارڪر جي هن سرگرمي کي ڳنڍڻ جي اجازت ڏئي ٿي ان مفروضي ۾ پوئين مشاهدي سان ته RNA وائرس جي هڪ طبقي ۾ آر اين اي سنٿيسس جي شروعات فنڪشنل ۽ ارتقائي طور تي مطابقت رکي ٿي.
Nidovirales (Coronaviridae، Arterioviridae، ۽ 12 ٻيا خاندان) جو RNA-انحصار RNA پوليمريز (RdRps) پولي پروٽين مان نڪرندڙ غير ساختي پروٽين (nsp) ۾ امينو ٽرمينل (N-terminal) ڊومين سان ڳنڍيل آهي، جنهن کي NiRAN سڏيو ويندو آهي. 1ab وائرل مين پروٽيز (Mpro) مان ٺهيل آهي.اڳي، ارٽيريل وائرس NiRAN-RdRp nsp جي پنهنجي GMPylation/UMPylation سرگرمي جي رپورٽ ڪئي وئي هئي، ۽ اهو تجويز ڪيو ويو هو ته نيوڪليو سائڊ مونوفاسفٽ (NMP) جي منتقلي لاءِ (في الحال اڻڄاتل) وائرس ۽/يا سيل بايوپوليمرائيزيشن شيون.هتي، اسان ڏيکاريون ٿا ته ڪورونوايرس (انساني ڪورونوايرس [HCoV]-229E ۽ سخت شديد تنفسي سنڊوم ڪورونوايرس 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ۾ Mn2+-انحصار NMPylation سرگرمي آهي، جيڪا nsp9 مان نڪتل آهي Mpro-mediated nsp9 جي ٺهڻ ذريعي. N-terminal flanking nsps proteolytically جاري آهي، phosphoramidate nsp9 جي N-ٽرمينل تي پرائمري amine (N3825) سان ڳنڍيل آهي.uridine triphosphate ھن رد عمل ۾ ترجيحي نيوڪليوٽائڊ آھي، پر ايڊينوسائن ٽرائيفاسفيٽ، گانوسين ٽرائيفاسفيٽ، ۽ سائٽيڊائن ٽرائيفاسفيٽ پڻ مناسب ذيلي ذيلي ذخيرا آھن.ميوٽيشن مطالعو recombinant ڪورونوايرس nsp9 ۽ nsp12 پروٽين ۽ جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل HCoV-229E ميوٽنٽ استعمال ڪندي نيران جي وچولي nsp9 NMPylation ۽ سيل ڪلچر ۾ وائرس جي نقل لاءِ ضروري باقيات کي طئي ڪيو.ڊيٽا NiRAN فعال سائيٽ جي رهائش جي اڳڪٿي جي تصديق ڪئي ۽ ويٽرو ۾ nsp9 NMPylation ۽ وائرس جي نقل ۾ nsp9 N3826 باقين جي اهم ڪردار کي طئي ڪيو.هي رهاڻ محفوظ ٿيل N-ٽرمينل NNE ٽرپيپٽائيڊ تسلسل جو حصو آهي ۽ اهو ثابت ٿيو آهي ته nsp9 ۽ ان جي هومولوگس جو واحد غير متضاد رهائشي ڪورون وائرس خاندان ۾.هي مطالعو ٻين اينٽيڊ وائرسز جي NMPylation سرگرمي جي فنڪشنل مطالعي لاءِ هڪ مضبوط بنياد فراهم ڪري ٿو ۽ اينٽي وائرل دوائن جي ترقي لاءِ ممڪن حدف پيش ڪري ٿو.
Nidovirales مثبت-stranded RNA وائرس مختلف قسم جي vertebrates ۽ invertebrates کي متاثر ڪري ٿو (1, 2).آرڊر ۾ في الحال 14 خاندان (3) شامل آهن، جن مان گذريل 20 سالن ۾ ڪورونوايرس خاندان جو وسيع اڀياس ڪيو ويو آهي.ان وقت، ٽي زونوٽڪ ڪورونوايرس جانورن جي لشڪر مان نڪرندا هئا ۽ انسانن ۾ سخت تنفس جي انفيڪشن جي وڏي پيماني تي ڦهليل هئا.مسلسل پنڊيمڪ سميت سخت شديد متاثر ٿيندڙ بيمارين جي ڪري.تنفس جي سنڊروم ڪورونا وائرس 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses هڪ عام جينوم تنظيم کي حصيداري ڪري ٿو، ۽ جھلي جي پابند ريپليڪشن-ٽرانسڪرپشن ڪمپليڪس (RTC) جي سب يونٽ کي 5-?²-ٽرمينل ٻن ٽين ۾ انڪوڊ ڪيو ويو آهي ۽ وائرس جي ذري جي مکيه ساختماني سبونٽ، گڏوگڏ ڪجهه لوازمات. .پروٽين، جينوم جي 3 ??² آخر ٽئين ۾ انڪوڊ ٿيل (1).پلانري وائرس جي هڪ خاندان جي سواءِ (Monoviridae) (8)، سڀ nested وائرس RTC subunits کي ٻن وڏن اوپن ريڊنگ فريم (ORF) ORF1a ۽ ORF1b ۾ انڪوڊ ڪندا آهن، جن کي جينومڪ RNA مان ترجمو ڪيو ويو آهي.ORF1a پوليو پروٽين (pp) 1a کي انڪوڊ ڪري ٿو، ۽ ORF1a ۽ ORF1b گڏيل طور تي pp1ab کي انڪوڊ ڪري ٿو.ORF1a پاران انڪوڊ ٿيل مکيه پروٽيز (Mpro) جي عام شموليت سان، pp1a ۽ pp1ab ٻئي پروٽيولائيڪل طور تي مختلف غير ساختي پروٽينن (nsps) ۾ پروسيس ڪيا ويندا آهن، جن کي 3CLpro پڻ چيو ويندو آهي، ڇاڪاڻ ته ان ۾ picornavirus جي 3Cpro سان homology آهي ( 9).اهي nsps هڪ وڏي متحرڪ RTC ۾ گڏ ڪيا وڃن ٿا، جينومڪ آر اين اي (نقل) ۽ سبجينومڪ آر اين اي جو هڪ سيٽ (ٽرانسڪرپشن) جي تجزيه کي متحرڪ ڪن ٿا، ۽ ORF1b (10) جي هيٺئين پاسي واقع ORF جي اظهار کي همٿائڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا آهن. ؟12).
بنيادي RTC ۾ شامل آهن RNA-انحصار RNA پوليمريز (RdRp) (13)، سپر فيملي 1 هيليڪيس (HEL1) (14، 15) ۽ ڪيترائي آر اين اي پروسيسنگ اينزائمز، جيڪي بنيادي طور تي ORF1b ۾ انڪوڊ ٿيل آهن ۽ ڪورون وائرس جي خاندان ۾ شامل آهن nsp12-nsp16 ۽. nsp9-nsp12 Arterioviridae خاندان ۾ (ڏسو حوالو 10-12).RdRp ۽ HEL1 پکين جي نسٽ وائرس جي ٻن (هڪ پنجون) محفوظ ڊومينز جي نمائندگي ڪن ٿا ۽ ٻين آر اين اي وائرس جي وچ ۾ هومولوجي آهي.ڪور ريپليڪس کي ٻين ذيلي يونٽن جي مدد سان مڃيو وڃي ٿو، جنهن ۾ pp1a جي ڪاربوڪسي ٽرمينل (سي-ٽرمينل) علائقي مان جاري ڪيل ڪيترائي ننڍڙا nsps، Mpro جي هيٺان (ڪورونا وائرس nsp5 ۽ arterial virus nsp4، ترتيب سان) شامل آهن.انهن وٽ محدود خانداني مخصوص تحفظ ۽ مختلف سرگرميون آهن (جائزو ڏنو ويو حوالو 10-12).
نسبتا تازو، هڪ ڊومين منفرد ترتيب واري نموني خاصيتن سان ملي ويو امينو ٽرمينس (N-terminus) تي RdRp جي ڀرسان سڀني اينسٽ ٿيل وائرسز ۾، پر ٻيو ڪوبه آر اين اي وائرس (16).ان جي جڳھ ۽ نيوڪليوٽائڊ ٽرانسفيس (نيوڪليو سائڊ مونو فاسفيٽ [NMP] منتقلي) سرگرمي جي بنياد تي، ھن ڊومين جو نالو رکيو ويو آھي NiRAN (Nestvirus RdRp سان لاڳاپيل nucleotide transferase).NiRAN-RdRp جو ٻٽي ڊومين جو ميلاپ ڪوروناويرڊي خاندان ۾ nsp12 ۽ Arterioviridae خاندان ۾ nsp9 ٺاهي ٿو، ۽ ٻين nestoviridae ۾، NiRAN-RdRp کي وائرل پولي پروٽين مان هڪ آزاد nsp طور آزاد ٿيڻ جي اميد آهي.ڪورونا وائرس ۾، نيران ڊومين ۾ 1/450 باقيات شامل آهن ۽ سي-ٽرمينل RdRp ڊومين سان ڳنڍيل علائقي ذريعي ڳنڍيل آهي (16?19).Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) ۾، recombinant nsp9 ڏيکاري ٿو Mn2 + آئن-انحصار (خود) UMPylation ۽ GMPylation سرگرميون، جيڪي نيسٽوائرس، AN، BN ۽ CN ۾ ٽن محفوظ ڪيل تسلسل جي بنيادن تي منحصر آھن، تسلسل ۾ رھيل آھن.جتي N جو مطلب آهي NiRAN) (16).انهن نقشن جي اين-ٽرمينل فلانڪنگ هڪ گهٽ قدامت پسند نموني preAN آهي.انهن مان ڪجهه رهجي ويا آهن پري پري سان لاڳاپيل پروٽين ڪنيزن ۾، جتي انهن کي ڏيکاريو ويو آهي شامل ڪيو ويو نيوڪليسائڊ ٽرافاسفٽ (NTP) بائنڊنگ ۽ ڪيٽيليٽڪ سرگرمي (20, 21).هن مشاهدي سان مطابقت، Pseudomonas syringae کان pseudokinase SelO ۾ ڪيترن ئي اهم فعال سائيٽن جي باقيات کي تازو شايع ٿيل SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سپر ڪمپليڪس سان گڏ ڪري سگهجي ٿو.اليڪٽران مائڪرو اسٽريچر ۾ محفوظ ڪيل ڪورونوايرس NiRAN رهجي ويا آهن.ٻيهر ملندڙ پروٽين (17).اهو اندازو لڳايو ويو آهي ته دستاويز ٿيل (خود) U/GMPylation NMP کي منتقل ڪرڻ لاء هڪ عارضي حالت پيدا ڪندو (في الحال اڻڄاتل) سبسٽٽ (16)، ۽ NiRAN ۽ پروٽين kinase جي وچ ۾ ساخت جي هڪجهڙائي (17, 19) اهو مفروضو آهي. NiRAN ٻين پروٽينن کي تبديل ڪري ٿو.
ڪيتريون ئي خاصيتون، جن ۾ nested وائرسز سان ان جي منفرد ۽ منفرد منظم وابستگي ۽ RdRp کان جينياتي علحدگي شامل آهي، NiRAN کي nested وائرسز لاءِ هڪ معقول اهم ريگيوليٽري اينزائم بڻائي ٿو، جيڪو انهن جي ظاهر ٿيڻ ۽ سڃاڻپ لاءِ انتهائي اهم آهي.اڳي، ٽن ممڪن ڪمن کي شامل ڪيو ويو NiRAN جينوم / ذيلي جينومڪ ترجمي کي منظم ڪرڻ يا نقل / ٽرانسپشن کي سڏيو ويندو هو.جڏهن ان وقت موجود ناقص ۽ نامڪمل ڊيٽا تي غور ڪيو وڃي، هر فنڪشن جا پنهنجا فائدا ۽ نقصان آهن (16).هن تحقيق ۾، اسان جو مقصد آهي ته ٻن نسلن جي نمائندگي ڪندڙ ڪورونوايرس جي جيو ڪيميڪل ۽ ريورس جينياتي اڀياس کي گڏ ڪرڻ، ۽ اسان جي نتيجن کي ڪورونوايرس خاندان جي قدرتي ميوٽيشن جي ارتقائي پس منظر ۾ رکون، ته جيئن هن پراسرار دائري ۾ بصيرت حاصل ڪري سگهون.اسان آر ٽي سي ۾ قدرتي هدفن جي سڃاڻپ ذريعي نيران جي سمجھ ۾ وڏي پيش رفت جي رپورٽ ڪريون ٿا، جيڪي (ٽي موجود مفروضن جي وچ ۾) هن ڊومين جي ڪردار ۾ حصو وٺن ٿا نسٽڊ وائرس آر اين اي جي ترکیب کي شروع ڪرڻ ۾.هي تحقيق وائرس ميزبان انٽرفيس تي NiRAN جي ٻين ڪردارن لاءِ امڪانن کي به کولي ٿي.
ڪرونا وائرس nsp12 سان لاڳاپيل NiRAN ڊومين جي اينزيميٽڪ پراپرٽيز کي نمايان ڪرڻ لاءِ، اسان E. coli ۾ انساني ڪورونا وائرس 229E (HCoV-229E) nsp12 جو ٻيهر ٺهڪندڙ فارم تيار ڪيو، جنهن ۾ C-ٽرمينس تي His6 ٽيگ سان گڏ، پروٽين [α32-P] سان گڏ اين ٽي پي سان گڏ MnCl2 جي موجودگي ۾، جيئن مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيو ويو آهي.رد عمل جي پيداوار جو تجزيو اين ايس پي 12 (106 kDa) سان گڏ لڏپلاڻ ڪندڙ ريڊيو ليبل ٿيل پروٽين جي موجودگي کي ظاهر ڪري ٿو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪورونوايرس اين ايس پي 12 covalent پروٽين-NMP ايڊڊڪٽس جي ٺهڻ کي ترتيب ڏئي ٿو، ترجيحي طور تي يوريڊين مونوفاسفٽ (UMP) سان ٺهيل آهي (Figure 1) ب).مقدار جي تجزيي ڏيکاري ٿي ته ٻين nucleotides جي مقابلي ۾، UMP شامل ڪرڻ جي سگنل جي شدت 2 کان 3 ڀيرا وڌي وئي (شڪل 1C).هي ڊيٽا ڪورون وائرس جي نيران ڊومين جي اڳڪٿي ڪيل NMP منتقلي سرگرمي سان مطابقت رکي ٿي (16)، پر اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪورون وائرس جي نيران ڊومين جي نيوڪليوٽائيڊ ترجيحات ۽ شريان وائرس مختلف آهن.
HCoV-229E nsp12 جي خود NMPylation سرگرمي.(الف) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 30 منٽن لاءِ 6 mM MnCl2 جي موجودگي ۾ نامزد ٿيل [α-32P] NTP سان گڏ ڪيو ويو (تفصيل لاءِ مواد ۽ طريقا ڏسو).رد عمل جون شيون SDS-PAGE پاران جدا ڪيا ويا ۽ Coomassie شاندار نيري سان داغ ٿيل.(ب) ريڊيوليبل ٿيل پروٽين کي فاسفورس اميجنگ ذريعي ڏٺو ويو آهي.nsp12-His6 ۽ پروٽين جي ماليڪيولر ماس مارڪرز (kilodaltons ۾) A ۽ B ۾ ڏيکاريا ويا آهن. (C) ريڊيويڪل سگنل جي شدت (مطلب ± SEM) ٽن آزاد تجربن مان طئي ڪيو ويو.*P≤0.05.سگنل جي طاقت (فيصد) UTP سان لاڳاپيل آهي.
جيتوڻيڪ نيران سان لاڳاپيل اينزيم سرگرميون ڏيکاريا ويا آهن EAV ۽ SARS-CoV جي نقل لاءِ سيل ڪلچر (16)، مخصوص نيران فنڪشن ۽ امڪاني هدف اڃا تائين طئي نه ڪيا ويا آهن.تازو ٻڌايو ويو آهي NiRAN ۽ پروٽين جي هڪ خاندان جي وچ ۾ پروٽين kinase-like folds (17, 22) جي وچ ۾ هڪجهڙائي اسان کي هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ چيو ته NiRAN ٻين پروٽينن جي NMPylation کي متحرڪ ڪري ٿو.اسان ممڪنه هم جنس هدفن جو هڪ سيٽ ٺاهيو، جنهن ۾ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) پاران انڪوڊ ٿيل غير ساختماني پروٽين شامل آهن، هر هڪ C-terminal His6 tag تي مشتمل آهي (SI ضميمو، ٽيبل S1)، ۽ اين ايس پي 12 جي موجودگي يا غير موجودگي ۾ انهن پروٽينن کي [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) سان گڏ ڪريو.بوائن سيرم البومين ۽ MBP-LacZα فيوزن پروٽين جيڪي E. coli ۾ پيدا ڪيا ويا آهن ڪنٽرول طور ڪم ڪيو (شڪل 2A، لين 1 کان 7).تابڪاري واري پروٽين جو تجزيو ڪيو ويو سوڊيم ڊوڊيڪل سلفيٽ-پوليڪريلامائيڊ جيل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) ۽ آٽو ريڊيگرافي، ۽ اهو معلوم ٿيو ته رد عمل ۾ هڪ مضبوط ريڊيويڪل سگنل موجود هو جنهن ۾ nsp12 ۽ nsp9 شامل هئا.سگنل جي پوزيشن اين ايس پي 9 جي ماليڪيولر ڪاميٽي سان ملندڙ جلندڙ آهي، اين ايس پي 9 جي اين ايس پي 12-ثالث UMPylation (شڪل 2B، ٽريڪ 7) کي ظاهر ڪري ٿو.ٻيو ڪو به ٽيسٽ پروٽينس UMPylated نه مليو، جنهن جي نتيجي ۾ اسان اهو نتيجو ڪيو ته nsp9 nsp12 جو هڪ مخصوص ذيلي ذخيرو آهي.شڪل 1 ۾ ڏيکاريل خود-NMPylation ڊيٽا سان مطابقت، nsp12 سڀني چئن NMPs کي nsp9 ڏانهن منتقل ڪرڻ جي قابل آهي، جيتوڻيڪ ڪارڪردگي مختلف آهي، UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) تصوير).3 A ۽ B).هن جائزي ۾ استعمال ڪيل شرطن جي تحت (رد عمل ۽ نمائش جي وقت کي مختصر ڪريو، nsp12 جي ڪنسنٽريشن کي گھٽايو؛ مواد ۽ طريقا)، nsp12 جي خود NMPylation معلوم نه ٿي سگھيو (تصوير 2B، لين 7، ۽ شڪل 1B) جو مقابلو ڪريو. ھڪڙو اثرائتو ثابت ٿيو (۽ گھڻن رائونڊ) UMP منتقل ڪيو ويو nsp12 کان nsp9 تائين.UMP transferase سرگرمي کي Mn2 + آئنز جي موجودگي جي ضرورت آهي، جيئن شڪل 3C ۾ ڏيکاريل آهي، جڏهن ته Mg2+ جي موجودگي ۾ صرف گهٽ ۾ گهٽ UMP منتقلي سرگرمي ڏٺو ويو، ۽ آزمائشي ٻين ٻن ڊولنٽ ڪيشن جي موجودگي ۾ ڪابه سرگرمي.ساڳي ڊيٽا NMPylation assays ۾ حاصل ڪئي وئي جنهن ۾ cytidine triphosphate (CTP)، guanosine triphosphate (GTP)، ۽ adenosine triphosphate (ATP) (SI ضميمه، شڪل S1).
HCoV-229E nsp12-ثالث UMPylation of nsp9.پروٽين جي ذيلي ذخيرو جو هڪ سلسلو (بشمول بوائن سيرم البومين، MBP-lacZα، ۽ HCoV-229E nsps جو هڪ سلسلو C-terminal His6 سان ORF1a انڪوڊ ٿيل) HCoV-229E nsp12-Media6⁺ جي UMPylation سرگرمي کي جانچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. پروٽين.پروٽين کي [α-32P] UTP سان 10 منٽن لاءِ nsp12 جي غير موجودگيءَ ۾ (A) يا موجودگي (B) جيئن مواد ۽ طريقن ۾ بيان ڪيو ويو آهي.A ۽ B جي چوٽي تي، SDS-polyacrylamide جيل کي Coomassie Brilliant Blue سان داغدار ڏيکاريو ويو آھي، ۽ A ۽ B جي ھيٺان، لاڳاپيل آٽو ريڊيوگرام ڏيکاريا ويا آھن.پروٽين جي ماليڪيولر ماس مارڪر جي پوزيشن (kilodaltons ۾) کاٻي پاسي ڏني وئي آهي.nsp12-His6 (B, top) جي پوزيشن ۽ nsp9-His6 (B, لين 7) سان nsp12-His6 جي انڪيوبيشن دوران مشاهدو ڪيل ريڊيويڪل سگنل پڻ اشارو ڪيو ويو آهي، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته [α-32P] UMP کان nsp9-His6 (12.9 kDa)، جيڪو ٻين پروٽينن جي آزمائش لاء نه ڏٺو ويو.
HCoV-229E NiRAN-ثالث بايو ڪيميڪل ۽ وائرولوجيڪل خاصيت nsp9 NMPylation جي.(A ۽ B) رد عمل ۾ استعمال ٿيندڙ نيوڪليوٽيڊ ڪو-سبسٽرٽ جو ڪردار.Nsp12-His6 ۽ nsp9-His6 معياري NMPylation assay ۾ مختلف [α-32P] NTPs جي موجودگي ۾ ملايا ۽ incubated آهن.(اي، مٿي) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE پاران جدا ٿيل.(الف، هيٺيون) جيل جي ساڳئي علائقي جو آٽو ريڊيوگراف.(ب) تعلقي سرگرمي (مطلب ± SEM) نامزد ڪيل نيوڪليوٽائيڊ ڪوفيڪٽر جي موجودگي ۾ ٽن آزاد تجربن مان طئي ڪيو ويو آهي.*P≤0.05.(سي) ڌاتو آئنز جو ڪردار.ڏيکاريو ويو معياري NMPylation ٽيسٽ [α-32P] UTP ۽ مختلف ڌاتو آئنز جي موجودگي ۾، هر هڪ 1 ايم ايم جي ڪنسنٽريشن سان.C ۾، مٿي، Coomassie stained nsp9-His6 ڏيکاريو ويو آھي، ۽ C ۾، ھيٺئين، لاڳاپيل آٽوگرافي ڏيکاريل آھي.ليبل ٿيل پروٽين جي ماپ (ڪلوڊالٽن ۾) A ۽ C جي کاٻي پاسي ڏيکاريل آهي. (D) HCoV-229E nsp12-His6 جو ميوٽيٽ فارم جيڪو مخصوص امينو ايسڊ متبادل کڻندو آهي [α-32P]UTP ۾ آهي، جيئن بيان ڪيو ويو آهي. مواد ۽ طريقن ۾.NMPylation جي رد عمل ۾ پيدا ڪيل ريڊيوبلبلڊ nsp9-His6 فاسفوريليشن اميجنگ (ڊي، ٽاپ) ذريعي معلوم ٿئي ٿو.وائلڊ-قسم (wt) پروٽين جي مقابلي ۾ لاڳاپو سرگرمي ڊي ۾ ڏيکاريل آهي، ۽ هيٺيون حصو ورتو ويو آهي اوسط (±SEM) ٽن آزاد تجربن مان.Asterisks غير محفوظ ٿيل بقايا جي متبادل جي نشاندهي ڪن ٿا.(E) p1 سيلز جي ڪلچر سپرنيٽنٽ ۾ وائرس ٽائيٽل 24 ڪلاڪن کان پوءِ حاصل ڪيو ويو آهي انفڪشن جي تختي جي چڪاس ذريعي.انجنيئر ٿيل HCoV-229E ميوٽنٽ جي NiRAN ڊومين ۾ ڪوڊون متبادل اشارو ڪيو ويو آهي (رڪيڊيو نمبرنگ pp1ab ۾ انهن جي پوزيشن تي ٻڌل آهي).نقل جي گھٽتائي RdRp فعال سائيٽ ميوٽيٽ nsp12_DD4823/4AA ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو.
NiRAN جي فعال سائيٽ جي گهڻي ڄاڻ حاصل ڪرڻ لاء ۽ nsp9-مخصوص NMP منتقلي جي سرگرمي سان لاڳاپيل بقايا جو تعين ڪرڻ لاء، اسان ميوٽيشن تجزيو ڪيو، جنهن ۾ اسان نيران AN، BN ۽ CN نقشن ۾ قدامت پسند رهائشن کي تبديل ڪيو ( 16) اهو الا آهي (SI ضميمو، شڪل S2).ان کان علاوه، قدامت پسند Arg-to-Lys يا Lys-to-Arg متبادل جو اثر ٻن ڪيسن ۾ جائزو ورتو ويو.هڪ (منفي) ڪنٽرول جي طور تي، باقي بچيل آهن جيڪي ڪورونا وائرس جي NiRAN ڊومين ۾ يا گهٽ محفوظ نه آهن ۽ ٻين nested وائرسن کي Ala سان تبديل ڪيو وڃي ٿو. BN) ۽ D4280A (CN) خاص طور تي nsp12 ذريعي nsp9 NMPylation کي گھٽائي يا ختم ڪري ٿو، جڏهن ته قدامت پسند متبادل سان پروٽين (R4178K)، K4116R) انهن جي سرگرمي جو 60٪ ۽ 80٪ برقرار رکي ٿو، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته انهن جي حوالي سان پابندين جي آرام سان. زنجير جسماني ڪيميڪل طور تي حساس آهي (شڪل 3D).E4145A، D4273A، F4281A ۽ D4283A ڪيترن ئي ٻين محفوظ ٿيل ريزيديز کي تبديل ڪرڻ تمام گهٽ نقصانڪار آهي، ۽ nsp9 UMPylation صرف اعتدال سان گهٽجي وئي آهي.ساڳيا نتيجا حاصل ڪيا ويا nsp9 NMPylation رد عمل ۾ جن ۾ ٻين NTPs شامل آهن (شڪل 3D ۽ SI ضميمه، شڪل S3)، تصديق ڪري ٿو ته مخصوص امينو اسيد جي متبادل تي مشاهدو اثر استعمال ٿيل نيوڪليوٽائيڊ ڪو-سبسٽريٽ جي قسم کان آزاد آهن.اڳيون، اسان سيل ڪلچر ۾ ڪورونوايرس جي نقل تي انهن اين ايس پي 12 متبادل جي ممڪن اثر جي جانچ ڪئي.ان مقصد لاءِ، اسان 5 -7 سيلز کي نقل ڪرڻ لاءِ ريزومبيننٽ ويڪسينيا وائرس (23, 24) ۾ ڪلون ٿيل جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل ڪمپليمينٽري ڊي اين اي (سي ڊي اين اي) ٽيمپليٽ استعمال ڪيو.انهن سيلن ۾ پيدا ٿيندڙ متاثر ٿيندڙ وائرس جي نسل جي ٽائيٽليشن ڏيکاري ٿي ته اڪثر HCoV-229E NiRAN ميوٽنٽ ممڪن نه هئا (شڪل 3E).غير قابل عمل وائرل ميوٽنٽ جي هڪ گروپ ۾ متبادل شامل آهن جيڪي ڏيکاريا ويا آهن ختم ڪرڻ يا خاص طور تي ويٽرو ۾ NMP منتقلي سرگرمي کي گهٽائڻ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), پر اتي ٻه ٻيا متبادل آهن (K4116R, E414A) % محفوظ؟انهن ۾ ويٽرو NMPylation سرگرمي ڏيکاري ٿي ته اضافي پابنديون شامل آهن.اهڙي طرح، ٻه ٻيون ميوٽيشنز (R4178K, F4281A) جيڪي NiRAN جي ان ويٽرو NMPylation سرگرمي ۾ معمولي گهٽتائي سبب زنده وائرس پيدا ڪيا، جڏهن ته، انهن وائرسن نقل جي ذريعي ٽائيٽرز کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو.شڪل 3D ۾ ڏيکاريل ان ويٽرو سرگرمي ڊيٽا سان مطابقت، چار ٻين باقيات کي تبديل ڪرڻ جيڪي ڪورونوايرس ۽/يا ٻين نسٽڊ وائرسز ۾ محفوظ نه آهن (K4113A، D4180A، D4197A، D4273A) (8، 16) پيدا ڪيا قابل عمل وائرس، اولاد هجڻ جي باوجود جهنگلي قسم جي وائرس (شڪل 3E) جي مقابلي ۾ هڪ معتدل گهٽتائي ٽائيٽل.
مطالعي ڪرڻ لاء ته ڇا NiRAN-ثالث NMP transferase سرگرمي فعال RdRp ڊومين تي منحصر آهي، RdRp motif C ۾ divalent metal ions (11) جي ڪوآرڊينيشن ۾ ملوث ٻه محفوظ Asp باقيات Ala سان تبديل ڪيا ويا. نتيجي ۾ پروٽين nsp12_DD4823/4AA برقرار رکي ٿو. ان جي nsp9 NMPylation سرگرمي، ظاھر ڪري ٿي ته nsp12-ثالث ان vitro nsp9 NMPylation سرگرمي کي پوليميرس سرگرمي جي ضرورت نه آھي (SI ضميمو، شڪل S4).
nsp9-specific NMP transferase سرگرمي قائم ڪرڻ کان پوءِ nsp12 لاءِ، اسان ڪوشش ڪئي ته NMP-nsp9 addduct کي ماس اسپيڪٽروميٽري (MS) ذريعي نمايان ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي.مڪمل پروٽين ماس اسپيڪٽرم جي ٻيهر ٺهڻ واري HCoV-229E nsp9 هڪ چوٽي ڏيکاري ٿي 12,045 Da (Figure 4A).nsp12 جو اضافو nsp9 جي معيار کي تبديل نه ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته nsp12 ۽ nsp9 استعمال ٿيل شرطن جي تحت هڪ مستحڪم ڪمپليڪس نه ٺاهي سگهندا (تصويري 4A).UTP ۽ GTP جي موجودگي ۾، nsp9 ۽ nsp12 تي مشتمل رد عمل جي ماس ماپي ترتيبوار ڏيکاري ٿي ته UTP جو پروٽين ماس 306 Da منتقل ڪيو ويو، ۽ GTP جو پروٽين ماس 345 Da منتقل ڪيو ويو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هر nsp9 انو هڪ UMP يا GMP سان ڳنڍيل آهي. (تصوير 4) سي ۽ ڊي).اهو اندازو لڳايو ويو آهي ته NiRAN-mediated nsp9 NMPylation لاءِ گهربل توانائي NTP هائيڊولائيزيشن ۽ پيروفاسفٽ ڇڏڻ مان ايندي آهي.جيتوڻيڪ اين ايس پي 12 (اينزائم) جي ڀيٽ ۾ اين ايس پي 9 (ٽارگٽ) جو 10-گنا وڌيڪ استعمال ڪيو ويو ان رد عمل ۾، اين ايس پي 9 جي تقريبن مڪمل NMPylation مشاهدو ڪيو ويو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اين ايس پي 12 ۽ اين ايس پي 9 جي وچ ۾ رابطي جو مختصر وقت آهي، ۽ اين ايس پي 12 وڌيڪ اين ايس پي 9 کي NMPylate ڪري سگهي ٿو. ويٽرو ماليڪيول ۾.
nsp9 جو سنگل NMPylation nsp12 ۽ UTP يا GTP جي موجودگي ۾.HCoV-229E nsp9 (SI ضميمه، جدول S1) (AD) جو deconvoluted مڪمل پروٽين ماس اسپيڪٽرم ڏيکاريو ويو آهي.(A) nsp9 اڪيلو، (B) nsp9 + nsp12-His6، (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP جي موجودگي ۾، (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP جي موجودگي ۾.
اين ايس پي 9 جي باقيات کي طئي ڪرڻ لاءِ nsp12 پاران UMPylated، nsp9-UMP ٽرپسن سان صاف ڪيو ويو.نتيجي ۾ پيدا ٿيندڙ پيپٽائڊس کي نانو-هاءِ ڪارڪردگي مائع ڪروميٽوگرافي (HPLC) ذريعي الڳ ڪيو ويو ۽ آن لائن ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري (MS/MS) ذريعي تجزيو ڪيو ويو.بائيونڪ سافٽ ويئر پيڪيج (پروٽين ميٽرڪس) استعمال ڪندي ڊيٽا جو تجزيو اين-ٽرمينل امينو اسيد جي UMPylation ڏيکاريو.اهو دستي طور تي تصديق ٿيل آهي.اڳڪٿي پيپٽائڊ جو ٽينڊم ماس اسپيڪٽرم [UMP]NNEIMPGK (SI ضميمو، شڪل S5A) 421 m/z تي هڪ ٽڪرو ظاهر ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته UMP nsp9 جي باقي 1 سان ڳنڍيل آهي.
nsp9 جي اين-ٽرمينس تي، Asn آرٿوڪوروناويريني جي ميمبرن جي وچ ۾ محفوظ آهي (SI ضميمه، شڪل S6).جيتوڻيڪ اسان يقين رکون ٿا ته اين ٽرمينل پرائمري امين نائٽروجن UMP لاء سڀ کان وڌيڪ امڪاني قبول ڪندڙ آهي، اسان N-ٽرمينل تي NMP پابند جي اضافي ثبوت حاصل ڪرڻ جو فيصلو ڪيو.انهي سبب لاء، غير NMPylated ۽ NMPylated N-Terminal peptide nsp9 HPLC پاران صاف ڪيو ويو ايسٽون ۽ سوڊيم سائانوبوروهائيڊڊ جي موجودگي ۾.انهن حالتن جي تحت، صرف مفت پرائمري امائن کي پروپيل (25) سان تبديل ڪري سگهجي ٿو.N-terminal nsp9-derived peptide NNEIMPGK جي تسلسل سان ٻن پرائمري امينن تي مشتمل آھي، ھڪڙو Asn جي N-terminus تي ۽ ٻيو Lys جي پاسي واري زنجير تي C-terminus تي.تنهن ڪري، پروپيل گروپن کي ٻنهي سرن تي متعارف ڪرايو وڃي ٿو.غير NMPylated پيپٽائڊس جا نڪتل آئن ڪروميٽوگرام SI ضميمه، شڪل S5B ۾ ڏيکاريا ويا آھن.جيئن توقع ڪئي وئي، اين ٽرمينل ۽ سي ٽرمينل (مونو) پروپيلٽيڊ (SI ضميمه، شڪل S5B، اپر لين) ۽ ڊپروپيليٽ ٿيل پيپٽائڊس (SI ضميمه، شڪل S5B، لوئر لين) جي سڃاڻپ ٿي سگھي ٿي.اهو نمونو nsp9 جي NMPylated N-terminal peptide جي استعمال سان تبديل ٿئي ٿو.انهي صورت ۾، صرف سي-ٽرمينل پروپيليٽ ٿيل پيپٽائڊس کي سڃاڻي سگهجي ٿو، پر اين ٽرمينل پروپيليٽ ٿيل پيپٽائڊس ۽ ڊيپروپيليٽ پيپٽائڊس جي سڃاڻپ نه ڪئي وئي آهي (SI ضميمه، شڪل S5C)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته UMP کي منتقل ڪيو ويو آهي N-ٽرمينل پرائمري امائن کي روڪڻ لاء. تبديليون ڪرڻ کان گروپ.
اڳيون، اسان (Ala يا Ser سان) تبديل ڪريون ٿا يا nsp9 جي N-terminus تي محفوظ ڪيل بقايا کي حذف ڪريون ٿا حدف جي مخصوص رڪاوٽن کي بيان ڪرڻ لاءِ.اسان جي MS ڊيٽا جي بنياد تي ڏيکاريو ويو آهي ته NiRAN nsp9-NMP addduct ٺاهيندو آهي nsp9 جي N-ٽرمينل residue جي پرائمري amine سان، اسان اهو تصور ڪيو ته nsp9 NMPylation کي وائرل ماسٽر پروٽيز (Mpro، nsp5) جي ضرورت آهي nsp9 N-ٽرمينل کي ڇڏڻ لاءِ. ان جي polyprotein precursor.هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ، اسان اڳوڻو پروٽين nsp7-11 پيدا ڪيو جنهن ۾ nsp9 E. coli ۾ شامل آهي ۽ [α-32P] UTP (مواد ۽ طريقا) جي موجودگي ۾ هڪ معياري NMPylation ٽيسٽ ڪئي.جيئن ته شڪل 5A (لين 3) ۾ ڏيکاريل آهي، اڻ کٽ ٿيل nsp7-11 اڳوڻو nsp12 سان ريڊيو ليبل ٿيل نه آهي.ان جي ابتڙ، جيڪڏهن nsp7-11 recombinant nsp5 ذريعي لڪايو وڃي ٿو ته اڳوڻن مان nsp9 (۽ ٻيا nsps) ڇڏڻ لاءِ، هڪ ريڊيو ليبل ٿيل پروٽين جيڪو nsp9 سان لڏپلاڻ ڪري ٿو، معلوم ٿئي ٿو، اسان جي نتيجي جي تصديق ڪري ٿي ته NiRAN ۽ N- covalent nsp9-NMP اشتهارن جي چونڊيل ٺهڻ. .اين ٽرمينل اسن جو ٽرمينل پرائمري امائن (پوزيشن 3825 ۾ pp1a/pp1ab).اهو نتيجو پڻ nsp9 تعمير استعمال ڪندي تجربن جي حمايت ڪئي آهي، جنهن ۾ N-terminus تي هڪ يا ٻه اضافي رهائش شامل آهن.ٻنهي صورتن ۾، اين ايس پي 9 جي نيران-ثالث UMPylation کي ختم ڪيو ويو (SI ضميمه، شڪل S7).اڳيون، اسان 3825-NNEIMPK-3832 پيپٽائڊ جي ترتيب مان nsp9 جي N-ٽرمينل تي ختم ٿيل هڪ يا ٻه Asn باقين سان هڪ پروٽين پيدا ڪيو.ٻنهي صورتن ۾، nsp9 UMPylation مڪمل طور تي بلاڪ ڪيو ويو (شڪل 5B)، اضافي ثبوت مهيا ڪري ٿو ته حقيقي nsp9 N-terminus NMP ريڪٽر جي طور تي ڪم ڪري ٿو.
اين ايس پي 9 جي پروٽوولوٽيڪ پروسيسنگ ۽ اين ايس پي 12-ثالث UMPylation ۾ اين ٽرمينل ريزيڊيوشن جو ڪردار.(الف) nsp9 UMPylation جي ضرورت آھي ھڪ مفت nsp9 N-ٽرمينل.Nsp7-11-His6 اڳ ۾ 30 °C تي 30 °C تي NMPylation ڊيٽڪشن بفر تي مشتمل آھي جيڪو UTP تي مشتمل آھي recombinant Mpro (nsp5-His6) جي موجودگي يا غير موجودگي ۾.3 ڪلاڪن کان پوء، NMPylation assay شروع ڪريو nsp12-His6 شامل ڪندي جيئن بيان ڪيل مواد ۽ طريقن ۾.nsp5-His6 (لين 1) ۽ nsp9-His6 (لين 2) تي مشتمل ردعمل ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو.10 منٽن کان پوء، رد عمل ختم ڪيو ويو ۽ رد عمل جو مرکب SDS-PAGE پاران الڳ ڪيو ويو.پروٽين Coomassie شاندار نيرو سان داغ ڪيو ويو (A، مٿي).Nsp7-11-His6 اڳوڻن ۽ پروسيس ٿيل پراڊڪٽ جو نتيجو nsp5-His6 وچولي ٿيل ڪليويج ساڄي پاسي ڏيکاريل آهي.مهرباني ڪري نوٽ ڪريو (انهن جي ننڍڙي سائيز جي ڪري) ته nsp7 ۽ nsp11-His6 هن جيل ۾ ڳولڻ لائق نه آهن، ۽ رد عمل nsp5-His6 سان پورو ڪيو ويو آهي (لين 1 ۽ 4؛ nsp5-His6 جي پوزيشن هڪ مضبوط دائري طرفان ظاهر ڪيل آهي) يا nsp9-His6 (لين 2) ۾ MBP جي هڪ ننڍڙي مقدار شامل آهي (کليل حلقن طرفان ظاهر ڪيل) بقايا نجاست جي طور تي ڇاڪاڻ ته اهي MBP فيوزن پروٽين جي طور تي ظاهر ڪيا ويا آهن (SI ضميمه، ٽيبل S1).(B) Nsp9-His6 variant ۾ هڪ يا ٻه N-terminal Asn residues (residue numbering in the position of pp1a/pp1ab) جي کوٽ آهي ۽ nsp12-His6 ۽ [α-32P] UTP سان پاڪ ۽ انبيوٽ ٿيل آهي.B، SDS-PAGE Coomassie سان داغدار آهي، مٿي تي ڏيکاريل آهي، B، لاڳاپيل آٽو ريڊيوگراف هيٺان ڏيکاريل آهي.ماليڪيولر وزن مارڪر جي پوزيشن (ڪلوڊالٽن ۾) کاٻي پاسي ڏيکاريل آهي.(سي) HCoV-229E nsp9-His6 N-ٽرمينل محفوظ ڪيل ريزيديز کي Ala يا Ser سان تبديل ڪيو ويو، ۽ پروٽين جي ساڳئي مقدار کي استعمال ڪيو ويو nsp12-His6 وچولي ٿيل UMPylation رد عمل ۾.رد عمل جي شين کي SDS-PAGE پاران جدا ڪيو ويو ۽ Coomassie Brilliant Blue (C، Top) سان داغدار ڪيو ويو، ۽ ريڊيو ليبل ٿيل nsp9-His6 کي فاسفورسنس اميجنگ (سي، وچولي) پاران معلوم ڪيو ويو.استعمال ڪندي وائلڊ-قسم (wt) پروٽين کي ريفرنس جي طور تي (100٪ تي مقرر ڪيو ويو)، تعلقي NMPylation سرگرمي (مطلب ± SEM) ٽن آزاد تجربن مان ڳڻيو ويو.(ڊي) HCoV-229E جهنگلي قسم جي Huh-7 سيلز سان متاثر ٿيل Huh-7 سيلز جي p1 سيل ڪلچر سپرنيٽنٽ ۾ وائرس ٽائيٽرز، ۽ اين ايس پي 9 ۾ نامزد ٿيل امينو ايسڊ متبادل کڻندڙ ميوٽنٽ تختي جي امتحان ذريعي طئي ڪيا ويا.نقل جي گھٽتائي RdRp نموني سي ڊبل ميوٽيٽ DD4823/4AA منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو.
nsp9 جو N-ٽرمينس (خاص طور تي پوزيشن 1، 2، 3، ۽ 6) آرٿوڪوروناويريني سب فيملي (SI ضميمه، شڪل S6) جي ميمبرن جي وچ ۾ تمام گهڻو محفوظ آهي.nsp12-mediated nsp9 NMPylation ۾ انهن بقايا جي ممڪن ڪردار جي مطالعي لاء، اين ايس پي 9 جي N-ٽرمينس تي ٻه لڳاتار Asn رهجي ويا Ala يا Ser سان تبديل ڪيا ويا (اڪيلو يا ميلاپ ۾).وائلڊ-قسم nsp9 جي مقابلي ۾، Ala يا Ser سان N3825 کي تبديل ڪرڻ جي نتيجي ۾ nsp12-ثالث UMPylation (شڪل 5C) ۾ ٻه ڀيرا گھٽتائي ٿي.اسان جي نتيجي سان مطابقت رکي ٿي ته NMPylation N-terminal پرائمري amine تي ٿئي ٿي N-terminal Residue جي پاسي واري زنجير جي بدران، اسان N3825A ۽ N3825S جي بدلي سان اهم بقايا NMPylation جو مشاهدو ڪيو.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، جيڪڏهن ٻئي Asn کي Ala يا Ser سان تبديل ڪيو وڃي ٿو، nsp9 UMPylation وڌيڪ مضبوطيءَ سان گھٽجي ويندي آهي (10 ڀيرا کان وڌيڪ)، جڏهن ته Ala جي جاءِ تي 3، 4 ۽ 6 جي بدلي ۾ صرف nsp9 UMPylation تي هڪ معتدل اثر آهي (شڪل 2) ) .5 سي).ساڳي نتيجا حاصل ڪيا ويا ATP، CTP يا GTP استعمال ڪندي (SI ضميمه، شڪل S8).مجموعي طور تي، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا اهم ڪردار N2826 (nsp9 ۾ پوزيشن 2) nsp9 NMPylation ۾.
nsp9 ۽ NMPylation جي N-terminus جي وچ ۾ فنڪشنل رابطي جي اضافي ثبوت حاصل ڪرڻ لاء، اسان ڪورونوايرس خاندان جي nsp9 ترتيب جي هڪ کان وڌيڪ ترتيب واري ترتيب (MSA) کي انجام ڏنو (مختلف 104 ۽ 113 باقين جي وچ ۾) (SI ضميمه، شڪل. S6).مجموعي طور تي، Orthocoronavirinae subfamily جي 5 نسلن جي 47 (سڃاتل ۽ پوکيندڙ) نسلن ۾ جيڪي مختلف ٿلهي جانورن، پکين ۽ ريپٽائل ميزبانن کي متاثر ڪن ٿا، مجموعي طور تي صرف 8 باقي بچيل مليا.سڀ کان وڌيڪ وسيع تبديليون، حذف ڪرڻ ۽ داخل ڪرڻ سميت، nsp9 جي ثانوي ساخت جي عناصر جي وچ ۾ چڪر ۾ ڏٺو ويو، جيئن اڳئين ساخت جي اڀياس (26 ?? 28).اين ايس پي 9 جي سي ٽرمينل حصي جي β اسٽرينڊ ۽ α هيلڪس ۾ پنج غير متضاد رهجي ويا.ٽي غير متضاد باقيات nsp9 جي N ٽرمينس جي NNE نقشي کي ٺاهيندا آهن.اهو انڪشاف ڪيو ويو آهي ته هن نقشي جو ٻيو Asn واحد غير متضاد رهجي ويو آهي، جيڪو پڻ دور سان لاڳاپيل ڏيڏر ڪورونا وائرس جي فرضي اين ايس پي 9 طرفان شيئر ڪيو ويو آهي، ۽ Alphaletovirus جي ذيلي خاندان Letovirinae ۾ Microhyla letovirus 1 نسل جي نمائندگي ڪري ٿو.nsp9 ثانوي ڍانچي جي عناصرن ۾ رھائشن جو تحفظ فولڊنگ يا سڃاتل RNA بائنڊنگ ملڪيتن کي برقرار رکڻ لاءِ ڍانچي جي لحاظ کان منطقي ڪري سگھجي ٿو.بهرحال، هي دليل اين اين اي جي تحفظ تي لاڳو ٿيڻ نٿو لڳي، ۽ هن مطالعي کان اڳ، پابنديون جي فطرت جيڪا ٽرپپٽائڊ ترتيب جي تبديلي کي محدود ڪري ٿي، مڪمل طور تي لڪايو ويو.
ڪورونا وائرس جي نقل ۾ nsp9-NMPylation ۽ NNE تحفظ جي اهميت کي طئي ڪرڻ لاءِ، اسان HCoV-229E ميوٽنٽ تيار ڪيا، جيڪي nsp9 N-ٽرمينل باقيات جا سنگل يا ڊبل متبادل کڻن ٿا، ظاهر ڪن ٿا ته nsp9 NMPylation ويٽرو ۾ نقصانڪار آهي.اسان شروع ڪرڻ کان اڳ، اسان ان سوال جو جواب ڏيڻ جي ڪوشش ڪريون ٿا ته ڇا اهي متبادل (nsp8|9 cleavage سائيٽ جي ويجھو) C-terminal pp1a علائقي جي پروٽوليٽڪ پروسيسنگ کي متاثر ڪن ٿا.nsp7-11 پوليو پروٽينن جو هڪ سيٽ nsp9 جي N-ٽرمينس تي لاڳاپيل متبادلن تي مشتمل E. coli ۾ پيدا ڪيو ويو ۽ ٻيهر ڪمبينيٽ Mpro سان ڪٽيو ويو.چئن سائيٽن جي پروٽوليٽڪ ڪليويج (بشمول اين ايس پي 9 فلانڪنگ سائيٽ) ڪنهن به متعارف ٿيل متبادل (SI ضميمه، شڪل S9) کان خاص طور تي متاثر نه ٿيندي آهي، سواءِ انهن پروٽينن ۾ ساخت جي تبديلين جيڪي Mpro-mediated nsp8|9 cleavage سان مداخلت ڪن ٿيون (يا ٻيون) ويب سائيٽ.
Huh-7 سيلز جينوم-لمبائي HCoV-229E RNA سان تبديل ڪيا ويا، اين ايس پي 9 اين ٽرمينس تي محفوظ ڪيل اين اين اي ٽرپيپٽائڊس (N3825، N3826، ۽ E3827) ۾ انڪوڊنگ Ala يا Ser متبادلات، ڏيکاري ٿو ته اڪثر ميوٽيشنز موتمار آهن.اسان N-ٽرمينل Asn (N2835A يا N2835S) جي Ser يا Ala کي تبديل ڪندي وائرس کي بچائڻ ۾ ڪامياب ٿي ويا، پر NNE تسلسل (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) ۾ ٻين سنگل ۽ ڊبل ميوٽيشنز سان وائرس کي بحال ڪرڻ ۾ ناڪام ٿي ويا. NN3825/6SS) , E3827A) (شڪل 5D).
اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ٽشو ڪلچر ۾ ڪورون وائرس جي نقل کي محدود ڪيو ويو آهي (ساڳي يا ساڳي)، جسم ۾ nsp9 NMPylation سائيٽن جي قدرتي ميوٽيشن کي محدود ڪرڻ، ۽ ڪورونوايرس جي زندگي جي چڪر ۾ هن ردعمل جي اهم ڪردار جي حمايت ڪندي.
تجربن جي آخري سيٽ ۾، اسان تيار ڪيو C-ٽرمينل His6 ليبل ٿيل SARS-CoV-2 nsp12 ۽ nsp9، ۽ E. coli ۾ nsp12 جا ٻه ميوٽيٽ فارم.NiRAN ۽ RdRp ڊومينز ۾ فعال سائيٽ جي باقيات کي ترتيب سان استعمال ڪيو ويو Ala بدران (شڪل 6A ۽ SI ضميمه، ٽيبل S2).SARS-CoV-2 nsp12 ۾ K4465 HCoV-229E ۾ K4135 سان ملندڙ جلندڙ آهي (SI ضميمو، شڪل S2)، جيڪو ثابت ٿيو ته NiRAN سرگرمي ۽ HCoV-229E نقل (شڪل 3D ۽ E) لاءِ گهربل آهي.ھي رھائش پڻ شريانين وائرس EAV nsp9 K94 residue سان ملندڙ جلندڙ آھي، جنھن کي اڳي ڏيکاريو ويو ھو ته NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) لاءِ ضروري آھي.جيئن ته شڪل 6B ۾ ڏيکاريل آهي، SARS-CoV-2 nsp12 ۾ UMP ٽرانسفيس سرگرمي آهي nsp9 کي سبسٽريٽ استعمال ڪندي، جڏهن ته nsp12_K4465A فعال سائيٽ ميوٽيٽ غير فعال آهي.RdRp motif C جي SDD جي خصوصيت واري ترتيب ۾ ٻٽي متبادل UMP منتقلي سرگرمي (شڪل 6B) تي اثر انداز نٿو ٿئي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته RdRp سرگرمي nsp9 UMPylation ۾ سڌو سنئون اثر نه آهي.ساڳي ڊيٽا CTP، GTP ۽ ATP استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي (SI ضميمه، شڪل S10).تت ۾، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ڪورونوايرس ۾ هڪ قدامت پسند سرگرمي آهي جيڪا orthocoronavirus subfamily جي مختلف نسل جي نمائندگي ڪري ٿي.
SARS-CoV-2 nsp12-ثالث NMPylation of nsp9.(الف) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel NMPylation ٽيسٽ ۾ استعمال ٿيل ريٽومبيننٽ پروٽين کي ڏيکاري ٿو.ڪنٽرول جي طور تي، SARS-CoV-2 nsp12 جي NiRAN ڊومين (K4465A) ۽ RdRp ڊومين (DD5152/3AA) ۾ فعال سائيٽ جي متبادل سان هڪ ميوٽيٽ پروٽين استعمال ڪيو ويو.رھائشي نمبرنگ pp1ab ۾ پوزيشن تي ٻڌل آھي.(ب) nsp9-His6 ۽ [α-32P]UTP کي nsp12-His6 (جهنگلي قسم [wt] ۽ ميوٽنٽ) جي ذيلي ذخيري جي طور تي استعمال ڪندي UMPylation جو پتو لڳائڻ جو Autoradiograph.ليبل ٿيل پروٽين جي ماليڪيولر ماس (ڪلوڊالٽن ۾) کاٻي پاسي ڏيکاريل آهي.
NiRAN ڊومينز عام طور تي Nidovirales (16) ۾ محفوظ ڪيا ويا آهن، ظاهر ڪن ٿا ته اهي اينزيميٽڪ رد عمل کي متحرڪ ڪن ٿا Nidovirus نقل لاءِ ضروري آهن.هن مطالعي ۾، اسان اهو ثابت ڪرڻ جي قابل ٿي ويا آهيون ته ڪورونوايرس جو NiRAN ڊومين NMP (NTP مان ٺاهيل) nsp9 ڏانهن منتقل ڪري ٿو، هڪ پراسرار آر اين اي بائنڊنگ پروٽين جيڪو وائرس جي نقل ۾ شامل آهي (26 ?? 29)، ان کي قدرتي حدف جي طور تي طئي ڪرڻ لاء. ڪورونا وائرس RTC جو ساٿي.
NiRAN ڊومين ٽن ترتيب واري نقشن کي حصيداري ڪري ٿو (AN، BN، ۽ CN)، جنهن ۾ تمام ننڍڙو تعداد موجود آهن جيڪي سڀني خاندانن ۾ محفوظ آهن monophyletic پر انتهائي مختلف Nidovirales آرڊر (8, 16).تازيون اڀياس ڏيکاريا آهن ته اهي بنيادي طور تي غير معمولي خاندان سان لاڳاپيل آهن پروٽين kinase جهڙوڪ پروٽين، جن کي اصل ۾ SelO خاندان سڏيو ويندو هو (17, 19, 22, 30, 31).SelO سان لاڳاپيل پروٽين ۾ kinase فولڊ آهن، پر ڪلاسيڪل ڪنيزس ۾ ڪيترائي محفوظ ٿيل فعال سائيٽ جي باقيات نه آهن (22، 32).فعال سائيٽ تي پابند ATP ماليڪيولز جي ريورس اورينٽيشن جي بنياد تي ۽ مخصوص رابطي جي ذريعي مستحڪم، SelO تصور ڪيو ويو ۽ بعد ۾ AMP (فاسفٽ جي بدران) کي پروٽين جي ذيلي ذخيري ڏانهن منتقل ڪرڻ جي تصديق ڪئي وئي (22)، جڏهن ته هڪ ٻيو بيڪٽيريا SelO جهڙو پروٽين YdiU آهي. تازو ڏيکاريو ويو آهي ته يو ايم پي جي ڪوولنٽ منسلڪ کي ٽائر ۽ مختلف پروٽين جي ذيلي ذيلي ذخيري جي باقيات (33).
ڪورونوايرس نيران ڊومين جي پوٽيٽيو فعال سائيٽ جي باقيات جي اڳڪٿي جي تصديق ۽ وڌائڻ لاء، اسان ڪورونوايرس اين ايس پي 12 (شڪل 3D ۽ E ۽ SI ضميمه، شڪل S3 ۽ ٽيبل) S1â تي ميوٽيشن تجزيو ڪرڻ لاء بايو ڪيميڪل ۽ ريورس جينياتي طريقا استعمال ڪيا. S4).ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته HCoV-229E K4135، R4178 ۽ D4280 جي بدلي Ala سان ويٽرو NMP منتقلي سرگرمي ۽ سيل ڪلچر ۾ وائرس جي نقل کي ختم ڪري ٿي (شڪل 3D ۽ E ۽ SI ضميمه، شڪل S3)، NTP γ-phosphate ۾ انهن جي موجودگي جي حمايت ڪندي. (K4135، R4178) ۽ فعال سائيٽ جي ڌاتو آئن جي همراه (D4280).E4145A جي متبادل Glu جي محفوظ ڪيل Glu جي رينج ۾ پکين جي آڱوٺي وائرس جي K4135 (17) پوزيشن کي مستحڪم ڪرڻ جي اڳڪٿي ڪئي وئي وائرل نقل کي ختم ڪرڻ لاءِ ڏيکاريو ويو، پر حيرت انگيز طور تي، سرگرمي کي برقرار رکيو ويو ان ويٽرو NMPylation assay (شڪل 3D ۽ E ۽ SI ضميمو، شڪل S3 ۽ جدول S1-S4).ھڪڙو ساڳيو مشاهدو ڪيو ويو جڏھن لاڳاپيل متبادل متعارف ڪرايو ويو YdiU homolog of Salmonella typhimurium (E130A) (33).گڏ ڪيو ويو، اهي ڊيٽا ڪيٽيليٽيڪڪ فنڪشن جي بجاء هن محفوظ ڪيل رهائش جي ريگيوليٽري فنڪشن کي سپورٽ ڪن ٿا.
HCoV-229E NiRAN ڊومين (8) ۾ nestovirus جي حد اندر محفوظ ٿيل Phe residue (F4281A) کي تبديل ڪرڻ جي نتيجي ۾ ويٽرو ۾ NMPylation سرگرمي ۾ گهٽتائي ۽ سيل ڪلچر ۾ وائرس جي نقل ۾ وڏي گهٽتائي (شڪل 3D، E ۽ SI) ضميمه، شڪل S3).ڊيٽا هن ريزيڊيو جي اهم ريگيوليٽري فنڪشن سان مطابقت رکي ٿي، جيئن ته اڳ ۾ ڏيکاريل هوموولوس DFG motif Phe residue.ڪلاسيڪل پروٽين جي ڪنيز ۾، اهو Mg2 + پابند لوپ جو حصو آهي ۽ اسپائن کي گڏ ڪرڻ ۽ منظم ڪرڻ ۾ مدد ڪري ٿو؟؟؟مؤثر ڪيٽيلائيٽ سرگرمي لاء گهربل (32، 34).Ala ۽ Arg کي K4116 جي باقيات لاءِ متبادل بڻايو (preAN motif ۾)، ترتيب وار، وائرل نقل کي ختم ڪري ڇڏيو ۽، جيئن توقع ڪئي وئي، ويٽرو ۾ NMP Transferase سرگرمي تي مختلف اثر ڇڏيا، ان جي بنياد تي متعارف ڪرايل امينو ايسڊ سائڊ زنجير تي (شڪل 3D ۽ E ۽ SI ضميما) ، شڪل S3).فنڪشنل ڊيٽا ڍانچي جي معلومات سان مطابقت رکي ٿي، انهي مان ظاهر ٿئي ٿو ته هي رهائش ATP فاسفٽ (17) سان رابطو قائم ڪيو آهي.ٻين nested وائرس خاندانن جي NiRAN ڊومين ۾، HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 جي پوزيشن Lys، Arg يا His (8) جي قبضي ۾ آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هن مخصوص رهائش جي فنڪشنل پابندي کي آرام ڪيو ويو آهي.D4188A ۽ D4283A جي متبادل کي ختم ڪري ٿو يا مضبوط طور تي اينزيم سرگرمي کي گھٽائي ٿو ۽ وائرس جي نقل کي ختم ڪري ٿو (شڪل 3).اهي ٻه رهجي ويا آهن اڪثر (پر سڀ نه) اندر ٿيل وائرس (8) ۾ محفوظ آهن، هڪ اهم خانداني مخصوص پر ممڪن طور تي غير ڪيٽيليٽڪ فنڪشن کي ظاهر ڪن ٿا.Ala متبادل ڪيترن ئي ٻين Lys ۽ Asp جي باقيات (K4113A، D4180A، D4197A ۽ D4273A) جيڪي ڪورونوائريڊا يا ٻين Nestioviridae خاندانن ۾ محفوظ نه آهن (8) ڪنٽرول طور استعمال ڪيا ويا.جيئن توقع ڪئي وئي، اهي متبادل گهڻو ڪري قابل برداشت آهن، اينزيم سرگرمي ۾ معمولي گهٽتائي ۽ ڪجهه ڪيسن ۾ وائرل نقل سان (شڪل 3 ۽ SI ضميمه، شڪل S3).مجموعي طور تي، ڪورونوايرس ميوٽيجنيسس ڊيٽا EAV NiRAN-RdRp (16) جي خود-GMP ۽ ريورس جينياتي ڊيٽا سان تمام گهڻي مطابقت رکي ٿي، جنهن ۾ EAV nsp9 (ڪورونا وائرس nsp12 آرٿولوج) باقي K94 (HCoV- 229E K4135 سان لاڳاپيل)، اهم افعال. R124 (R4178 سان ملندڙ جلندڙ)، D132 (D4188 سان ملندڙ جلندڙ)، D165 (D4280 سان ملندڙ جلندڙ)، F166 (F4281 سان ملندڙ جلندڙ).ان کان علاوه، HCoV-229E mutagenesis ڊيٽا سان مطابقت رکي ٿي ۽ اڳئين رپورٽ ڪيل SARS-CoV ريورس جينياتي ڊيٽا (16) کان وڌايو ويو آهي، بلڪل بلڪل انهن سان ملندڙ جلندڙ آهي جيڪي لاڳاپيل CN motif Phe-to-Ala ميوٽيٽ SARS-CoV_nsp12 لاءِ مشاهدو ڪيو ويو آهي. phenotype بيان ڪيل -F219A ۽ HCoV-229E_F4281A (شڪل 3 ڊي ۽ اي ۽ SI ضميمو، شڪل S3 ۽ ٽيبل S1-S4).
EAV orthologs (16) جي مقابلي ۾، جن کي UTP ۽ GTP لاءِ واضح ترجيح آهي (خود-NMPylation ردعمل ۾)، اسان جو مطالعو ڏيکاري ٿو ته ڪورونوايرس NiRAN ڊومين (جي نمائندگي HCoV-229E ۽ SARS-CoV-2) مؤثر طريقي سان ٿي سگهي ٿو. سڀني چار NMPs کي منتقل ڪيو ويو، جيتوڻيڪ اتي UMP لاء معمولي ترجيح آهي (شڪل 1 ۽ 3).مخصوص NTP co-substrate جي نسبتا گھٽ خصوصيت تازو رپورٽ ڪيل SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سپر ڪمپوزائٽ ڍانچي سان مطابقت رکي ٿي، جنهن ۾ ADP-Mg2+ NiRAN جي فعال سائيٽ سان جڙيل آهي، پر ايڊينائن پارٽ سان نه. مخصوص رابطي جي ٺهڻ (17).اسان جي مطالعي ۾، NMPylation رد عمل ۾ استعمال ڪيل نيوڪليوٽائيڊ جو قسم ميوٽيٽ پروٽين (SI ضميمه، تصوير S3) جي سرگرمي تي ڪو به فرق نه آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته انهن مان ڪو به بقايا هڪ مخصوص نيوڪليو بيس جي پابند سان ويجهي سان لاڳاپيل ناهي.مختلف اين ٽي پي ڪو-سبسٽريٽ ترجيحن جي ساخت جي بنياد ۽ امڪاني حياتياتي اهميت جو مشاهدو ڪيو ويو آهي NiRAN ڊومينز ۾ ڪورونوايرس ۽ شريان وائرس جو مطالعو ڪيو وڃي ٿو؛اهي شايد سچا هجن يا انهن جي لاڳاپيل مطالعي جي حدن جي ڪري هجن.في الحال، ان ڳالهه کي رد نٿو ڪري سگهجي ته شريانين وائرس NiRAN ڊومين جي امڪاني NMPylator سرگرمي (اڳوڻي خصوصيت واري سيلف-NMPylation سرگرمي جي مقابلي ۾) مختلف ڪو-سبسٽريٽ ترجيحات رکي ٿي، ان ڳالهه کي نظر ۾ رکندي ته شريان ۽ ڪورونا وائرس جي وچ ۾ هڪجهڙائي آهي. NiRAN ڊومين پنهنجي حد تي آهي.تسلسل جي بنياد تي موازنہ (16).pseudokinase SelO جي مقابلي ۾، جيڪو Mg2+ ڪوفيڪٽر طور استعمال ڪري ٿو، ڪورون وائرس ۽ شريانين وائرس NiRAN جي سرگرمي Mn2+ (16) تي منحصر آهي (شڪل 3C ۽ SI ضميمو، شڪل S1).Mn2+ انحصار ۽ UTP لاءِ واضح ترجيح پروٽين NMPylators جي هڪ غير معمولي خصوصيت آهي، ۽ تازو ئي سالمونلا ٽائيفيموريم جي YdiU پروٽين ۾ تصديق ڪئي وئي آهي، جيڪو سخت Mn2+-انحصار پروٽين چپرون UMPylation کي ڪٽالائيز ڪري ٿو ته جيئن سيلز کي دٻاءُ جي انڊڪشن سيل ATP پول ( 33).
تازو بيان ڪيل ساختي هڪجهڙائي جي وچ ۾ ڪورونوايرس نيران ڊومين ۽ سيلولر پروٽين ڪائنسز (17, 19) NiRAN جي صلاحيت لاء اضافي مدد فراهم ڪري ٿي NMP کي ٻين پروٽينن سان ڳنڍڻ لاء اسان هن مطالعي ۾ ٻڌايو آهي.اسان پنھنجي ڳولھا کي ممڪن NiRAN ھدف لاءِ ھدف ڪيو آھي انھن پروٽينن تي جيڪي HCoV-229E ORF1a پاران انڪوڊ ٿيل آھن، جيڪي سڃاتل آھن سڌي يا اڻ سڌي طرح RTC جي ORF1b-انڪوڊ ٿيل ريپليڪس (12، 35) جي مدد ڪن ٿا.اسان جا تجربا nsp9 جي اثرائتي ۽ مخصوص NMPylation لاءِ حتمي ثبوت مهيا ڪن ٿا (شڪل 2).جيڪڏھن ھدف واري پروٽين کي داغ جي اضافي ۾ استعمال ڪيو وڃي ٿو جيڪو اينزيم (nsp12) کان 8 کان 10 ڀيرا وڌيڪ آھي، اھو تصديق ٿئي ٿو ته nsp9 مڪمل طور تي (مونو) NMPized آھي (شڪل 4).اسان ان نتيجي تي پهتاسين ته nsp12 ۽ nsp9 جي وچ ۾ رابطي جو مختصر وقت آهي ۽ nsp9 (ٻين RTC subunits جي غير موجودگي ۾) سان هڪ مستحڪم پيچيده نه ٺاهيندو.اهو نتيجو SARS-CoV proteome (35) تي پروٽين جي رابطي واري مطالعي جي حمايت ڪئي آهي.MS تجزيو nsp9 جي N-terminal Residue جي بنيادي amine جي سڃاڻپ ڪئي NMPylation سائيٽ (SI ضميمو، شڪل S5).فاسفوراميڊيٽ بانڊ ۽ اين ٽرمينل امينو گروپ جي ٺهڻ نيران-ثالث NMPylation سرگرمي کي Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation رد عمل کان ڌار ڪري ٿو، جيڪو Ser، Thr، يا Tyr residuces تي O-linked AMP جي ٺهڻ کي متحرڪ ڪري ٿو. 22)، ۽ S. typhimurium YdiU ٺاهي ٿو O-linked (Tyr سان) ۽ N-linked (سان) peptide-UMP addducts.پروٽين جي SelO خاندان تي موجود محدود معلومات ظاهر ڪري ٿي ته هن وڏي پروٽين جي خاندان جا ميمبر پيپٽائڊ-NMP اضافو جي ٺهڻ ۾ تمام گهڻو مختلف آهن.هي هڪ دلچسپ مشاهدو آهي جيڪو وڌيڪ مطالعي جي لائق آهي.
هن مطالعي ۾ حاصل ڪيل ڊيٽا اسان کي اهو سمجهڻ جي هدايت ڪئي ته nsp9 جي NMPylation کي مفت N-terminus جي ضرورت آهي.وائرل نقل جي حوالي سان، هي اين ايس پي8اڪثر ڪوروناوائرس ۾، هن مخصوص سائيٽ (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) ۽ ٻين سڀني ڪورون وائرس Mpro cleavage سائيٽن جي وچ ۾ فرق Asn آهي (بلڪه هڪ ٻي ننڍڙي رهائش جي بدران، جهڙوڪ Ala، Ser يا Gly) P1â تي قبضو ڪن ٿا؟؟؟جڳھ (36).شروعاتي مطالعي ۾ حاصل ڪيل پيپٽائڊ ڪليويج ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته nsp8|nsp9 سائيٽ جي ڪليويج ڪارڪردگي ٻين سائيٽن جي ڀيٽ ۾ گهٽ هئي، انهي مان ظاهر ٿئي ٿو ته 1) هن مخصوص سائيٽ کي سي-ٽرمينل جي بروقت هموار ٿيل پروسيسنگ ۾ ريگيوليٽري ڪردار ٿي سگهي ٿو. pp1a علائقو، يا 2) وائرس جي نقل ۾ خاص محفوظ ڪيل اين ايس پي 9 اين ٽرمينس جو ڪردار (37).اسان جي ڊيٽا (شڪل 5A) ڏيکاريو ويو آهي ته nsp9 جي ٻيهر ٺهڪندڙ فارم حقيقي N-ٽرمينل تسلسل کي مؤثر طور تي NMP12 پاران NMP ڪيو ويو.N-terminal flanking sequence فيڪٽر Xa (nsp9-His6؛ SI ضميمه، Table S1) يا Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6؛ شڪل 5A ۽ SI ضميمو، ٽيبل S1) ذريعي هٽايو ويو.خاص طور تي، اڻ کٽ nsp9- مشتمل اڳوڻو nsp7-11-His6 ڏيکاريو مزاحمت NSP12 جي NMPylation، جيڪو اسان جي ڊيٽا سان مطابقت رکي ٿو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته nsp9-NMP اضافو N-ٽرمينل پرائمري امائن ذريعي ٺهيل آهي (SI ضميمه، شڪل S5) .NiRAN ذيلي ذخيري جي خصوصيت جي وڌيڪ ڄاڻ حاصل ڪرڻ لاء، اسان پوء اين ايس پي 9 جي ڀرسان اين ٽرمينل جي باقيات تي ڌيان ڏنو.ٻين پروٽينن جي غير موجودگيءَ ۾، اهي ساخت جي لحاظ کان لچڪدار هوندا آهن، انهن کي nsp9 (26 28، 38) جي غير ليبل ٿيل شڪل ۾ معلوم ٿيڻ کان روڪيندا آهن، انهن جي محدود قدرتي تبديليءَ جي نشاندهي ڪري ٿي، اهو اهم تسلسل-مخصوص (ثانوي ساخت سان لاڳاپيل نه آهي) جي ڪري آهي. nsp9 N-ٽرمينل ٽڪرا جو ڪم.هن علائقي ۾ محفوظ ڪيل رهجي ويل الهام جي متبادل (شڪل 5C ۽ D ۽ SI ضميمه، شڪل S8) ظاهر ڪن ٿا ته N3826 ويٽرو ۾ nsp9 NMPylation لاءِ ضروري آهي، جڏهن ته N3825A ۽ E3827A متبادل NMPylation ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجن ٿا، جڏهن ته P3826 ذيلي ذيلي 3826 نه آهي. .واضح طور تي nsp9 NMPylation تي اثر انداز ٿئي ٿو.جيتوڻيڪ N-terminal Asn (N3825A, N3825S) جو متبادل صرف nsp9 NMPylation ۽ سيل ڪلچر (Figure 5C ۽ D) ۾ وائرس جي نقل، N-ٽرمينل 3825-NN dipe مان Asn جي رھائش واري تسلسل کي ختم ڪرڻ تي ھڪڙو اعتدال پسند اثر آھي. اهو ثابت ٿيو ته اهو وائرس لاءِ جان ليوا آهي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته N-ٽرمينس تي هڪ Asn جي باقي رهڻ جي ضرورت آهي، ترجيحي طور تي Asn، جيتوڻيڪ اهو لڳي ٿو ته ساڳئي بقايا جي متبادل کي جزوي طور تي برداشت ڪري سگهجي ٿو (شڪل 5B، C، ۽ D).اسان ان نتيجي تي پهتا آهيون ته 3825-NN ڊيپٽائڊ، خاص طور تي محفوظ ۽ ضروري N3826 باقي بچيل ڪورونوايرس رينج (SI ضميمه، شڪل S6)، NiRAN جي فعال سائيٽ ۾ nsp9 N-terminus جي صحيح پابند ۽ واقفيت کي يقيني بڻائي ٿو.
Ala (E3827A) کي سڀني ذيلي خاندانن جي محفوظ ڪيل گلو لاءِ متبادل بڻايو ويٽرو ۾ nsp9 NMPylation برقرار رکي ٿو پر سيل ڪلچر (Figure 5C ۽ D) ۾ وائرس لاءِ خطرناڪ آهي، هن ريزيڊيو جي اضافي فنڪشن کي ظاهر ڪري ٿو، مثال طور، اهم ڳالهين ۾ (NMPylated يا اڻ سڌريل. ) nsp9 N-terminus ۽ ٻيا عنصر جيڪي وائرس جي نقل ۾ ملوث آهن.Nsp9 ميوٽيشنز nsp9 جي پروٽوولوٽڪ عمل کي متاثر نه ڪيو يا ڪنهن به ڀرپاسي nsps (39) (SI ضميمه، شڪل S9)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪيترن ئي nsp9 ميوٽيشنز جي جاندار فينوٽائپس جو مشاهدو ڪيو ويو سي پروٽوولوٽيڪ پروسيس-ٽرمينل pp1a علائقي جي خرابي جي سبب نه هئا. .
مٿي ڄاڻايل ڊيٽا ثبوت مهيا ڪري ٿي ته pp1a/pp1ab ۾ nsp8|9 ڪليويج سائيٽ جي Mpro-ثالثي علاج کان پوء، nsp9 جو N-terminus UMPylated ٿي سگھي ٿو (يا جزوي طور تي ٻي NMP سان تبديل ٿيل).ان کان علاوه، nsp9 جي N-terminus جو شاندار تحفظ (بشمول ڪورونوايرس خاندان ۾ واحد ۽ غير متضاد Asn باقي بچيل) ۽ هن مطالعي ۾ حاصل ڪيل ريورس جينياتي ڊيٽا (فگرز 3E ۽ 5D) اسان کي ان نتيجي تي پهچن ٿا ته بيان ڪيل nsp9 NMPylation. حياتياتي طور تي لاڳاپيل آهي ۽ ڪورونا وائرس جي نقل لاءِ ضروري آهي.ھن تبديليءَ جا فنڪشنل نتيجا رھندا رھيا مطالع ٿيڻ، مثال طور، اڳ بيان ڪيل (غير مخصوص) nsp9 (غير تبديل ٿيل فارم) RNA بائنڊنگ سرگرمي (2628) جي حوالي سان.N-terminal NMPylation شايد اين ايس پي 9 جي رابطي کي پروٽين يا آر اين اي ذيلي ذخيرو يا مختلف چار سطحي اسيمبلين جي ٺهڻ تي پڻ اثر انداز ڪري سگھي ٿي.انهن کي ڍانچي جي مطالعي ۾ ڏٺو ويو آهي ۽ تصديق ڪئي وئي آهي ته عملي طور تي ڪورونوايرس جي نقل سان لاڳاپيل آهي، جيتوڻيڪ خاص طور تي غير موجودگي ۾ هن ترميم جي صورت ۾ (26- ââ29، 40).
جيتوڻيڪ ڪورونوايرس نيران ڊومين جي ٽارگيٽ جي خاصيت اڃا تائين وڌيڪ تفصيل سان بيان ڪرڻ جي ضرورت آهي، اسان جي ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته ڪورونوايرس نيران ڊومين جي پروٽين جي ٽارگيٽ جي خاصيت تمام تنگ آهي.جيتوڻيڪ سڀني nidovirus خاندانن جي NiRAN ڊومين ۾ اهم فعال سائيٽن جي باقيات (8, 16) جو تحفظ انهن پروٽينن جي محفوظ ڪيل NMPylator جي سرگرمي کي مضبوط طور تي سپورٽ ڪري ٿو، هن ڊومين جي ذيلي بائنڊنگ کيسي جي باقيات جي سڃاڻپ جي تحفظ ۽ تحفظ کي خاص طور تي بيان ڪيو وڃي ٿو. , ۽ Nidovirales مقصدن جي مختلف خاندانن جي وچ ۾ مختلف ٿي سگھي ٿو.اهڙي طرح، ٻين nested وائرس جا لاڳاپيل هدف اڃا تائين طئي ڪيا ويا آهن.اهي nsp9 يا ٻين پروٽينن جا ريموٽ آرٿولوگ ٿي سگهن ٿا، ڇاڪاڻ ته پنجن replicase ڊومينز کان ٻاهر جيڪي ترتيبون عام طور تي nested وائرسن ۾ محفوظ ڪيون وينديون آهن گهٽ محفوظ هونديون آهن (8) جن ۾ Mpro ۽ NiRAN جي وچ ۾ جينوم ايري شامل آهن، انهن مان، nsp9 ۾ واقع آهي. ڪورونا وائرس.
ان کان علاوه، اسان في الحال ان امڪان کي رد نٿا ڪري سگھون ته NiRAN ڊومين ۾ اضافي (سيلولر سميت) ھدف آھن.هن معاملي ۾، اها ڳالهه قابل ذڪر آهي ته هن اڀرندڙ پروٽين NMPylators (NMPylators) (30، 31) ۾ بيڪٽيريا هومولوگس "ماسٽر ريگيوليٽر" آهن؟NMP مختلف قسم جي سيلولر پروٽينن کي منظم ڪرڻ يا ختم ڪرڻ لاء انهن جي هيٺئين سرگرمين کي ختم ڪرڻ لاء، اهڙي طرح مختلف قسم جي حياتياتي عملن ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو، جهڙوڪ سيلولر دٻاء جو جواب ۽ ريڊڪس هوميوسٽاسس (22، 33).
هن مطالعي ۾ (شڪل 2 ۽ 4 ۽ SI ضميمه، انگ اکر S3 ۽ S5)، اسان اهو ثابت ڪرڻ جي قابل ٿي ويا آهيون ته nsp12 UMP (NMP) حصو nsp9 ۾ هڪ واحد (محفوظ) پوزيشن ڏانهن منتقل ڪيو، جڏهن ته ٻين پروٽينن ۾ تبديل نه ڪيا ويا. استعمال ٿيل شرطن جي تحت، چڱي طرح بيان ڪيل (بلڪه ٿلهي جي ڀيٽ ۾) ذيلي ذيلي خاصيت جي حمايت ڪئي وئي آهي.انهي سان مطابقت، N-terminal nsp9 NMPylation جي مقابلي ۾، nsp12 جي پنهنجي NMPylation سرگرمي تمام گهٽ آهي، ان جي چڪاس لاءِ گهڻي وقت جي آٽو ريڊيگرافي جي نمائش جي ضرورت آهي، ۽ اين ايس پي 12 ڪنسنٽريشن ۾ 10-گنا اضافو استعمال ڪيو ويندو آهي.ان کان علاوه، اسان جو MS تجزيو nsp12 جي NMPylation لاء ثبوت مهيا ڪرڻ ۾ ناڪام ٿيو، جيڪو ڏيکاري ٿو ته NiRAN ڊومين خود NMPylation (بهترين طور تي) ھڪڙي ثانوي سرگرمي آھي.بهرحال، اهو ياد رکڻ گهرجي ته ٻين مطالعي کي ابتدائي ثبوت مهيا ڪيو ويو آهي ته بيڪٽيريا NMPylator جي خود-AMPylation جي حيثيت ٻين پروٽين جي ذيلي ذيلي ذخيري تي انهن جي NMPylation سرگرمي کي ڪنٽرول ڪري سگهي ٿي (22, 33).تنهن ڪري، EAV nsp9 (16) ۽ ڪوروناوائرس nsp12 (هن مطالعي) لاءِ رپورٽ ڪيل خود NMPylation سرگرمين جي ممڪن ڪارڪردگي اثرات جي تحقيق ڪرڻ لاءِ وڌيڪ تحقيق جي ضرورت آهي، جنهن ۾ سي-ٽرمينل RdRp ڊومين جي فولڊنگ تي تجويز ڪيل چاپرون جهڙو اثر شامل آهي ( 16)).
اڳي، nidoviral NiRAN ڊومين جي ممڪن هيٺئين دڙي واري ڪارڪردگي جي حوالي سان ڪيترن ئي مفروضن تي غور ڪيو ويو آهي، بشمول RNA ligase، RNA-capped guanylate transferase ۽ پروٽين جي پرائمنگ سرگرمي (16)، پر انهن مان ڪوبه به موجود هيٺيون وهڪرو افعال سان مطابقت ناهي.هيٺين پوزيشن ۾ حاصل ڪيل معلومات بلڪل ساڳئي وقت اضافي مفروضن کان سواء.هن مطالعي ۾ حاصل ڪيل ڊيٽا تمام گهڻي مطابقت رکي ٿي (پر ثابت نه ٿي سگهي) ته NiRAN ڊومين پروٽين-حوصلہ افزائي آر اين اي جي جوڙجڪ جي شروعات ۾ ملوث آهي.اهو اڳ ۾ ئي مڃيو ويو هو ته 5 ۾ NiRAN ڊومين جو ڪم؟²-آر اين اي ڪيپنگ يا آر اين اي لئگيشن ردعمل متاثر نه ٿيندا آهن انهن ۽ ٻين ڊيٽا جي حمايت.تنهن ڪري، مثال طور، NiRAN جي فعال سائيٽ کي عام بنياد جي طور تي محفوظ ٿيل Asp کي شامل ڪرڻ سمجهيو ويندو آهي (Pseudomonas syringae SelO ۾ D252؛ HCoV-229E pp1ab ۾ D4271؛ SARS-CoV-2 nsp12 ۾ D208) (SI ضميمه، شڪل 2 ).S2) (17, 22, 33)، جڏهن ته ATP-انحصار RNA ligase ۽ RNA ڪيپنگ اينزائم ۾ ڪيٽيليسس ڪوولنٽ اينزيم- (لائسيل-اين) -اين ايم پي وچولي ذريعي ڪيو ويندو آهي، جنهن ۾ هڪ غير تبديل ٿيل ليس ريزيڊيو شامل آهي ( 41).ان کان علاوه، محفوظ ڪيل پروٽين جي هدفن لاءِ ڪورون وائرس NiRAN جي قابل ذڪر ترتيب جي بنياد تي خصوصيت ۽ NTP ڪو-سبسٽريٽس لاءِ آرامده خاصيت (UTP کي ترجيح ڏئي ٿو) NiRAN-ثالث ڪيپنگ اينزيم يا RNA ligase-like functions جي مخالفت ڪري ٿي.
ظاهر آهي، تصديق ڪرڻ لاءِ تمام گهڻو اضافي ڪم جي ضرورت آهي ۽، جيڪڏهن ثابت ٿي وڃي ته، پروٽين-حوصلي واري آر اين اي جي جوڙجڪ ۾ nsp9-UMP (nsp9-NMP) جي ممڪن ڪردار جي وضاحت ڪريو، جيڪو ڪيترن ئي دلچسپ پر (اڃا تائين) اڳ ۾ ڄاڻايل رپورٽن کي ڳنڍيندو. .الڳ الڳ مشاهدو.مثال طور، اهو طئي ڪيو ويو آهي ته ڪورونوايرس جي منفي-اسٽريڊ آر اين اي جي پڇاڙي هڪ اوليگو (U) اسٽرينڊ (42, 43) سان شروع ٿئي ٿي.اهو مشاهدو ان خيال سان مطابقت رکي ٿو ته منفي-اسٽرينڊ آر اين اي جي ٺهڻ جي شروعات ڪئي وئي آهي UMPylated فارم nsp9 کي پولي (A) tail (triggers) سان پابند ڪرڻ سان، جيڪا شايد ان جي آر اين اي بائنڊنگ ذريعي ترقي يافته ٿي سگهي ٿي سرگرمي ۽/يا رابطي سان. ٻيو RTC پروٽين.nsp9 پاران مهيا ڪيل UMP حصو پوءِ nsp7/8/nsp12-ثالث oligouridylation لاءِ ”پرائمر“ طور استعمال ڪري سگھجي ٿو، جينومڪ RNA ۾ 3??²-poly(A) دم يا ٻيو oligo (A) تي مشتمل تسلسل استعمال ڪندي. ھڪڙي ٽيمپليٽ جي طور تي ڪم ڪري ٿو، ھڪڙي ميڪانيزم وانگر آھي جيڪو picornavirus VPg پروٽين (44) لاءِ قائم ڪيو ويو آھي.ڇا جيڪڏهن تجويز "غير معمولي" آهي؟؟؟؟(پروٽين-انڊسڊ) ناڪاري-اسٽرينڊ آر اين اي جي شروعات مشاهدن لاءِ هڪ ڪڙي مهيا ڪري ٿي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته ڪورونا وائرس جي منفي-اسٽرينڊ آر اين اي وٽ UMP (UTP جي بدران) ان جي آخر ۾ آهي (42)، جنهن کي سمجهيو وڃي ٿو ته nucleic acid Dicer هڪ اڻڄاتل uridine-specific endonuclease پاران ختم ٿيل فاسفوريليٽ کي صاف ڪري ٿو.جيڪڏهن تصديق ٿئي ٿي ته، هي نيوڪليڪ ايسڊ هائيڊولائيٽڪ سرگرمي nsp9 جي oligomeric UMPylated فارم کي 5 ² جي آخر ۾ نئين منفي اسٽرينڊ کان ڇڏڻ ۾ مدد ڪري سگهي ٿي.پروٽين پرائمنگ ۾ nsp9 جو ممڪن ڪردار پوئين ريورس جينيٽڪس جي مطالعي سان پڻ مطابقت رکي ٿو، جن ۾ ڏيکاريو ويو آهي ته nsp9 (۽ nsp8) تنقيدي ۽ خاص طور تي محفوظ ڪيل سيز-اداڪار آر اين اي عنصر سان ڪورونوايرس جينوم جي 3 آخر جي ويجهو آهي.45).هن رپورٽ موجب، انهن اڳين مشاهدن کي هاڻي ٻيهر جانچي سگهجي ٿو ۽ وڌيڪ تحقيق ذريعي وڌايو وڃي.
تت ۾، اسان جي ڊيٽا N-terminus تي RdRp سان ڳنڍيل هڪ ملڪيت جي نسٽڊ وائرس اينزيم ٽيگ جي مخصوص سرگرمي کي طئي ڪيو.ڪورونا وائرس ۾، هي نئون دريافت ڪيل NiRAN-ثالث UMPylator/NMPylator سرگرمي استعمال ڪيو ويندو آهي Mn2+ ۽ ڀرپاسي آسن جي باقين تي ڀروسو ڪرڻ ۽ N-ٽرمينل پرائمري امائن سان (گهٽ توانائي) فاسفورميڊيٽ بانڊز جي ٺهڻ جو سبب بڻجڻ.اين ايس پي 8nsp12 NiRAN فعال سائيٽ ۽ nsp9 ٽارگيٽ ۾ اهم رهاڻن جو تحفظ، SARS-CoV-2 سميت ٻن ڪورونا وائرس مان حاصل ڪيل ڊيٽا سان گڏ، مضبوط ثبوت مهيا ڪري ٿو ته nsp9 NMPylation هڪ ڪورونوايرس آهي قدامت پسند خاصيتون پڻ وائرس جي نقل ۾ هڪ اهم قدم آهن.دستياب ڊيٽا اسان کي ان نتيجي تي پهچن ٿا ته اين ايس پي 9 جي NMPylated فارم جو مخصوص ڪردار پروٽين-Induced RNA synthesis ۾ ڪرونا وائرس ۽ ٻين نسٽڊ وائرسز لاءِ هڪ مناسب منظر آهي، ۽ NiRAN ٻين اڻ ڄاتل پروٽينن کي به نشانو بڻائي سگهي ٿو.وائرس کي منظم ڪريو.ميزبان رابطي.جيڪڏهن تصديق ٿئي ٿي، وائرل RNA جي جوڙجڪ ۾ پروٽين جي پرائمر جي شموليت Mpro/3CLpro ۽ RdRp ڊومينز جي تسلسل لاڳاپي کي وڌائي سگهندي اڳ ۾ دريافت ڪيل ڪورونوايرس ۽ picornavirus-like supergroup (9) جي وچ ۾، جيڪي هاڻي تازو قائم ڪيل Pisonivirites (9) ۾ متحد ٿي ويا آهن. 46) درجي ۾.
اسان جي ڊيٽا پڻ ڏيکاري ٿي ته هن مطالعي ۾ سڃاڻپ بنيادي، چونڊ ۽ قدامت پسند اينزيم سرگرميون اينٽي وائرل دوائن جي مقصدن جي طور تي استعمال ڪري سگھجن ٿيون.مرکبات جيڪي NiRAN جي فعال سائيٽ ۾ محفوظ ٿيل nsp9 N-terminus جي پابند (۽ بعد ۾ ترميم) سان مداخلت ڪن ٿا، انهن کي موثر ۽ ورسٽائل اينٽي وائرل دوائن ۾ ترقي ڪري سگهجي ٿو، مختلف (ذيلي) جينس کان جانورن ۽ انساني ڪورونا وائرس جي علاج لاءِ موزون. ، بشمول SARS-CoV-2 ۽ مڊل ايسٽ ريسپيريري سنڊروم ڪورونا وائرس.
هن مطالعي ۾ پيدا ڪيل ڪورونوايرس پروٽين جي ڪوڊنگ جي ترتيب کي وڌايو ويو RT-PCR استعمال ڪندي RNA کان الڳ ٿيل Huh-7 کان متاثر ٿيل HCoV-229E يا Vero E6 سان متاثر ٿيل SARS-CoV-2، ۽ معياري ڪلوننگ طريقيڪار استعمال ڪندي داخل ڪيو ويو.pMAL-c2 (نيو انگلينڊ جي حياتياتي ليبارٽري) يا PASK3-Ub-CHis6 (47) ايڪسپريس ویکٹر (SI ضميمو، ٽيبل S1 ۽ S2).سنگل ڪوڊون متبادل متعارف ڪرايو ويو پي سي آر جي بنياد تي سائيٽ-هدايت واري ميوٽيجنيسس (48).MBP فيوزن پروٽين کي پيدا ڪرڻ لاء، E. coli TB1 سيلز کي مناسب pMAL-c2 پلاسمڊ تعمير سان تبديل ڪيو ويو (SI ضميمه، ٽيبل S1).فيوزن پروٽين کي amylose affinity chromatography ذريعي صاف ڪيو ويو ۽ فيڪٽر Xa سان صاف ڪيو ويو.تنهن کان پوء، C-terminal His6-tagged پروٽين کي صاف ڪيو ويو Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي (49).ubiquitin فيوزن پروٽين کي پيدا ڪرڻ لاء، E. coli TB1 سيلز مناسب pASK3-Ub-CHis6 پلاسمڊ تعمير (SI ضميمه، ٽيبل S1 ۽ S2) ۽ pCGI پلاسمڊ ڊي اين اي انڪوڊنگ ubiquitin-مخصوص سي-ٽرمينل هائيڊروولس 1 (Ubp1) استعمال ڪيو.تبديلي (47).C-terminal His6-tagged ڪورونوايرس پروٽين کي صاف ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي (50).
HCoV-229E nsp12-His6 جو خود NMPylation ٽيسٽ ڪيو ويو جيئن بيان ڪيل EAV nsp9 (16).مختصر ۾، nsp12-His6 (0.5 µM) تي مشتمل آهي 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH، pH 8.0، 5 mM dithiothreitol (DTT)، 6 mM MnCl2، buffate، 25mm بيان ڪيل NTP ۽ 0.17 µM ملائي [α32-P] NTP (3,000 Ci/mmol؛ Hartmann Analytic) 30 ° C تي 30 منٽن لاءِ.nsp12-ثالث nsp9 NMPylation جي ٻين سڀني (معياري) NMPylation assays ۾، رد عمل جون حالتون ھيٺ ڏنل ترتيب ڏنل آھن: nsp12-His6 (0.05 µM) ۽ nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) جي موجودگي ۾. )، 5 mM DTT، 1 mM MnCl2، 25 µM اشارو ڪيو ويو NTP، ۽ 0.17 µM مليل [α32-P]NTP.30 ° C تي 10 منٽن تائين پکڙڻ کان پوء، رد عمل جو نمونو SDS-PAGE نموني جي بفر سان ملايو ويو: 62.5 ايم ايم ٽريس (هائيڊروڪسيميٿيل) امينو ميٿين ايڇ سي ايل (پي ايڇ 6.8)، 100 ايم ايم ڊي ٽي ٽي، 2.5٪ SDS، 10٪ گليسرول ۽ 0.0005٪ بروفين نيرو.پروٽين کي 90 ° C تي 5 منٽن تائين گرم ڪرڻ سان رد ڪيو ويو ۽ 12٪ SDS-PAGE کان الڳ ڪيو ويو.جيل کي ڪومسسي برليئنٽ بليو سلوشن (40% ميٿانول، 10% ايسٽڪ ايسڊ، 0.05% ڪومسسي برليئنٽ بليو R-250) سان ٺھيل ۽ داغدار ڪيو ويو آھي، رنگين ٿيل، ۽ 20 ڪلاڪن لاءِ فاسفورسنٽ اميجنگ اسڪرين تي بي نقاب ڪيو ويو آھي (NMPy کان nsp12 کي معلوم ڪرڻ لاءِ) يا (وڌ ۾ وڌ) 2 ڪلاڪ (nsp9 NMPylation جو اندازو لڳائڻ لاءِ).هڪ ٽائيفون 9200 اميجر (GE Healthcare) اسڪرين کي اسڪين ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو ۽ ImageJ استعمال ڪيو ويو سگنل جي شدت جو تجزيو ڪرڻ لاءِ.
MS تجزيي لاءِ، 1 µM nsp12-His6 ۽ 10 µM nsp9 (بغير hexahistidine ٽيگ) NMPylation تجزيي ۾ استعمال ڪيا ويا (SI ضميمه، ٽيبل S1) ۽ 500 µM UTP ۽ GTP جي وڌندڙ ڪنسنٽريشن استعمال ڪيا ويا.انهن جي ڪنسنٽريشن ۽ متوقع پروٽين جي معيار تي مدار رکندي، هڪ واٽر ACQUITY H-Class HPLC سسٽم جيڪو MassPrep ڪالمن (Waters) سان ليس هو، 1 کان 10 µL بفر ٿيل پروٽين جي حلن کي آن لائن ختم ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.ختم ٿيل پروٽين کي Synapt G2Si ماس اسپيڪٽروميٽر (پاڻي) جي اليڪٽررو اسپري آئن ماخذ ۾ داخل ڪيو ويو آهي بفر A (water/0.05% formic acid) ۽ بفر B (acetonitrile/0.045% formic acid) جي هيٺئين درجي جي ذريعي، ۽ ڪالمن جو گرمي پد آهي. 60 ° C ۽ وهڪري جي شرح 0.1 mL/min: elution isocratically 5% A سان 2 منٽن لاءِ، پوءِ 8 منٽن جي اندر 95% B تائين لڪيريءَ جو درجو، ۽ ٻين 4 منٽن لاءِ 95% B برقرار رکڻ.
500 کان 5000 m/z جي ماس رينج سان مثبت آئنز معلوم ڪيا ويا آهن.Glu-fibrinopeptide B هر 45 سيڪنڊن ۾ ماپي ويندي آهي خودڪار ماس drift اصلاح لاءِ.MaxEnt1 ايڪسٽينشن سان MassLynx انسٽرومينٽ سافٽ ويئر استعمال ڪريو بيس لائين ۽ هموار ڪرڻ کان پوءِ سراسري اسپيڪٽرم کي ختم ڪرڻ لاءِ.
UMPylated HCoV-229E nsp9 کي هضم ڪيو ويو sequencing-grade modified trypsin (Serva) شامل ڪندي ۽ رات جو 37 ° C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو.هڪ Chromabond C18WP اسپن ڪالم (حصو نمبر 730522؛ Macherey-Nagel) پيپٽائيڊس کي ختم ڪرڻ ۽ مرڪوز ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.آخرڪار، پيپٽائڊ کي 25 µL پاڻيءَ ۾ گھليو ويو، جنھن ۾ 5% acetonitrile ۽ 0.1% formic acid ھو.
نمونن جو تجزيو ڪيو ويو MS پاران Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific) استعمال ڪندي.حتمي نانو HPLC سسٽم (Dionex)، ڪسٽم جي آخر ۾ نصب ٿيل 50 سينٽ سان ليس آهي؟75 μm C18 RP ڪالمن سان ڀريل 2.4 μm مقناطيسي موتي (ڊاڪٽر البن ماسچ هاءِ پرفارمنس LC GmbH) آن لائن ماس اسپيڪٽروميٽر سان ڳنڍيو Proxeon nanospray ذريعو ذريعي؛300 µm اندروني قطر ×؟؟1 سينٽي C18 PepMap پري ڪنسنٽريشن ڪالم (Thermo Scientific).پاڻي/0.05% فارمڪ ايسڊ کي محلول جي طور تي استعمال ڪندي، نموني کي 6 µL/min جي وهڪري جي شرح تي پاڻمرادو ڇڪايو ويو ۽ صاف ڪيو ويو.
پاڻيءَ جا هيٺيان درجا / 0.05٪ فارمڪ ايسڊ (سولوينٽ اي) ۽ 80٪ ايسٽونائيٽريل / 0.045٪ فارمڪ ايسڊ (سولوينٽ بي) استعمال ڪيا ويا 300 اين ايل / منٽ جي وهڪري جي شرح تي ٽرپٽيڪ پيپٽائڊس جي علحدگي حاصل ڪرڻ لاءِ: 4٪ بي لاءِ 5 منٽ، پوءِ 30 A لڪير گريڊينٽ 45% B تائين منٽن اندر، ۽ 5 منٽن اندر 95% سالوينٽ B تائين لڪير واڌارو.ڪروميٽوگرافڪ ڪالم کي اسٽينلیس اسٽيل نانو ايميٽر (Proxeon) سان ڳنڍيو، ۽ 2,300 V جي صلاحيت کي استعمال ڪندي ماس اسپيڪٽروميٽر جي گرم ڪيپيلري تي سڌو سنئون ايليونٽ اسپري ڪريو. آربيٽريپ ماس اينالائيزر ۾ 60,000 جي ريزوليوشن سان سروي اسڪين سان لاڳاپيل آهي. گھٽ ۾ گھٽ ٽي ڊيٽا MS/MS اسڪين سان، متحرڪ طور تي 30 سيڪنڊن لاءِ خارج ٿيل، لڪير آئن ٽريپ ڪوليشن انڊيوسڊ ڊسڪشن استعمال ڪندي يا آربيٽريپ ڊيٽڪشن سان گڏ اعليٰ توانائي جي ٽڪراءَ جي ڊسڪشن کي استعمال ڪندي، ريزوليوشن 7,500 آھي.
پوسٽ جو وقت: آگسٽ-03-2021